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关于Illumina CMOS 芯片和单通道 SBS 测序化学技术

发布者: 静待花开 | 发布时间: 2020-3-26 09:59| 查看数: 5| 评论数: 0 |帖子模式 |只看大图 |关灯


  简介从需求端看高通量测序公司更符合消费者的心理预期,愿意为心仪的事物买单。


  Illumina测序平台利用成熟的高精度边合成边测序(SBS)化学

  技术,这是世界上应用最广泛的新一代测序化学技术

  1。Illumina

  SBS通过一种基于可逆终止子的专利方法进行大规模平行测序,

  该方法可在单个碱基掺入不断延伸的DNA链时对其进行检测。

  IlluminaSBS测序化学技术利用四种核苷酸之间的天然竞争机制,

  降低了掺入偏好性,可对重复区域和同聚物区域进行更稳定的测

  序

  2。与基于毛细管电泳的Sanger测序相比,新一代测序(NGS)

  可以检测更广泛的DNA变异,包括低频变异和相邻定相变异,并

  且获得结果更快,操作步骤更少

  3,4。

  SBS测序化学为所有Illumina测序平台奠定了基础,而其光

  学系统经过发展已可支持四通道、双通道和单通道检测方法。

  iSeq100系统采用了最新的IlluminaSBS技术:结合在互补金属

  氧化物半导体(CMOS)芯片上的单通道SBS。单通道SBS方法

  使测序成本更低,且仪器仅占据1立方英尺的空间,十分便利。

  高度准确的SBS测序化学技术

  IlluminaSBS测序化学利用可逆标记的核苷酸对流动槽表面的数

  亿个簇进行平行测序(图1)。在每个测序循环中,单个标记的脱

  氧核糖核苷三磷酸(dNTP)被添加到核酸链中。核苷酸标记充当

  聚合反应的终止子。每掺入一个dNTP,就会对荧光染料进行成

  像,然后将其化学切除,以便掺入下一个核苷酸。通过测定每个

  循环的信号强度来直接进行碱基检出。由于与可逆终止子结合的

  四种dNTP(A、C、T、G)都以游离的单分子形式存在,天然竞

  争使得掺入偏好性降到了最低。此外,可逆终止确保了每个测序

  循环中每个模板链只掺入单个碱基,与其他技术相比大大提高了

  同聚物区域测序的准确度,且大大降低了原始错误率

  2。

  如需观看IlluminaSBS技术动画视频,请访问

  www.illumina.com/SBSvideo。

  AOFFON

  CONOFF

  TONON

  GOFFOFF

  化学反应1

  添加A和T带标记的1-染料混合物

  化学反应2

  添加新试剂,从A中去除标记,

  并给C添加标记

  图像1

  图像2

  A.

  B.

  ACTG

  一个完整的SBS循环

  ACTG

  图像1图像2结果

  图1:用单通道检测的IlluminaSBS-(A)iSeq100系统采用创新的单通

  道测序化学方法。每个测序循环包括两个化学步骤和两个成像步骤。第一

  个化学步骤将流动槽暴露给核苷酸混合物,该混合物中的腺嘌呤和胸腺嘧

  啶带有荧光标记。在第一个成像步骤中,由CMOS传感器记录来自每个簇

  的光发射。第二个化学步骤从腺嘌呤中去除荧光标记,并给胞嘧啶添加荧

  光标记。在两个化学步骤中,鸟嘌呤都是黑暗的(未标记)。记录第二个图像。

  (B)图像分析软件对图像1和图像2的组合进行处理,以鉴定各个簇位

  置掺入了哪些碱基。此测序循环重复“n”次,以产生“n”个碱基的读长。

  IlluminaCMOS芯片和单通道SBS测序化学技术

  iSeq?100系统结合了CMOS技术与创新的单通道SBS测序化学技术,以小巧的系统提供高度

  准确的数据

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  制备文库|测序|分析数据|支持

  四通道SBS测序化学技术

  在四通道SBS中,使用四种不同的荧光染料标记四种碱基,每个

  测序循环生成四种图像,由此对各碱基进行鉴定(图2A)。测序

  循环的第一个化学步骤是将四种带不同标记的碱基全部加入流动

  槽。掺入核苷酸之后,成像循环开始,包括利用四个不同波长带

  捕获四种不同的图像。用图像分析软件处理图像,确定流动槽中

  各个簇位置掺入了哪些核苷酸。因此,四通道测序中,每个测序

  循环需要四种染料和四个图像来确定DNA序列。目前,MiSeq?

  和HiSeq?系列系统使用的是四通道SBS。

  双通道SBS测序化学技术

  双通道SBS使用两种荧光染料和两种图像来测定四种碱基,

  而不是对每个碱基使用不同的染料,从而简化了核苷酸检测

  (图2B)。使用红色和绿色滤光带采集图像。胸腺嘧啶用绿色

  荧光基团标记,胞嘧啶用红色荧光基团标记,腺嘌呤用红色

  和绿色荧光基团共同标记。鸟嘌呤一直是黑暗的。MiniSeq?、

  NextSeq?和NovaSeq?系统采用的便是双通道测序化学技术。

  单通道SBS测序化学技术

  iSeq100系统将久经考验的IlluminaSBS测序化学与CMOS技

  术相结合,实现了单通道测序。该系统使用图案化流动槽和建有

  纳米孔的CMOS芯片(图3)。簇生成和测序在纳米孔中进行,纳

  米孔直接与每个光电二极管(像素)上的单个簇对齐。将CMOS

  传感器嵌入耗材可实现简单且快速的检测方法。

  四通道测序化学双通道测序化学单通道测序化学

  图像1

  图像2

  图像3

  图像4

  结果

  AGTC

  AGTC

  图像1

  图像2

  结果

  AGTC

  AGTC

  图像1

  图像2

  结果

  AGTC

  AGTC

  中间化学步骤

  图2:四通道、双通道和单通道测序化学-四通道测序化学使用四种不同荧光染料标记的核苷酸混合物。双通道测序化学使用两种不同的荧光染料,而单

  通道化学只使用一种染料。利用图像分析软件处理图像,以测定核苷酸。

  不同于每种核苷酸使用不同染料的四通道SBS测序化学技术,

  iSeq100系统使用一种染料、两个化学步骤,每个测序循环采集

  两次图像。在单通道测序化学技术中,腺嘌呤具有可移除的标记,

  并且仅在第一张图像中被标记。胞嘧啶具有可以结合标记物的接

  头基团,并且仅在第二张图像中被标记。胸腺嘧啶具有永久性荧

  光标记,因此在两张图像中均被标记,而鸟嘌呤则一直是黑暗的。

  通过分析两张图像中每个碱基的不同发光模式来识别核苷酸(图

  2C)。

  图3:IlluminaCMOS流动槽-将测序文库上样到iSeq100试剂卡盒中,

  其中包含装配在CMSO芯片上的图案化流动槽。流动槽中的每个孔都与

  CMOS光电二极管对齐。在簇生成过程中,专有的ExAmp测序化学技术

  确保流动槽中的每个孔仅产生单个克隆簇。在每个成像步骤中,由CMOS

  光电二极管检测光发射。

  激发光

  保护玻璃

  流动通道

  纳米孔

  滤光器

  光电二极管

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  制备文库|测序|分析数据|支持

  表1:变异分析的仪器比较

  系统与目标匹配的read百分比错配率覆盖均一性百分比

  a

  查准率(SNP)查全率(SNP)

  Panel1(BRCA)b

  iSeq10096.00.2310090.5100

  MiniSeq95.80.2110089.1100

  MiSeq95.80.2010089.1100

  Panel2(CHP2)

  iSeq10097.30.20100100100

  MiniSeq97.10.1799.0100100

  MiSeq96.80.1510098.6100

  Panel3(Focus)

  iSeq10096.50.2399.595.2100

  MiniSeq96.60.2098.992.9100

  MiSeq96.10.1999.094.0100

  a.百分比>0.2x平均值

  b.BRCApanel包含了BRCA1和BRCA2基因所有外显子区域中的265个扩增子;CHP2panel包含了覆盖50个癌基因和肿瘤抑制基因的207个扩增子;Focus

  panel包括涵盖53个基因的269个扩增子,用于多变量分析。

  所有系统的SBS精确度

  IlluminaSBS测序化学几乎可以在任何覆盖度水平上提供高度

  准确的测序数据,并能提供业界最高产的无错read以及最高

  比例的分值大于Q30*的碱基检出

  2,6,7。与其他Illumina平台

  一样,iSeq100系统也能生成高比例的大于Q30的碱基数据

  (图4)。为了对变异鉴定中的iSeq100系统数据与MiniSeq和

  MiSeq系统生成的数据进行比较评估,在这三个系统上运行并

  分析了三个扩增子panel(表1)。用Burrows-WheelerAligner

  (BWA)8、Picses变异检出软件

  9

  和Hap.pyBenchmarking软

  件

  10

  进行数据分析。用PlatinumGenomes参考数据集

  11

  计算查

  准率和查全率。结果显示,三个系统都具有相当的高质量比对、

  覆盖度和变异分析指标。

  由于所有Illumina测序系统都使用相同的基于可逆终止子的SBS

  技术,因此研究人员在进行研究时可以放心地在不同的Illumina

  测序系统之间转换。无论数据是由四通道、双通道还是单通道

  SBS生成的,都可以在BaseSpace?SequenceHub、Illumina

  基因组学计算环境或各种第三方分析工具中对结果进行比较和

  分析。

  *质量分值(Q值)是对碱基检出中错误发生几率的预测。30分的Q值(Q30)被广泛视

  为高质量数据的标准

  5。

  Q值

  20103040

  1800

  1400

  1000

  600

  200

  B.iSeq100运行

  A.NextSeq550系统运行

  95.0%≥Q30

  1.7G

  总碱基数(十亿)

  30402010

  0

  40

  0

  60

  80

  100

  Q值

  0

  总碱基数(百万)

  88%≥Q30

  89%≥Q30

  20

  图4:NextSeq500和iSeq100系统的质量分值-(A)NextSeq550系

  统的双通道SBS技术可提供高质量的数据,测序准确度为88%的碱基得

  分≥Q30。人类细胞系混合样本合并后以2×101bp的配置运行。(B)

  iSeq100系统单通道SBS测序化学技术提供相当高质量的数据。宏基因组

  学微生物混池以2×151bp进行测序,89%的碱基的数据质量≥Q30。

  Illumina中国

  上海办公室?电话?(021)6032-1066?传真?(021)6090-6279

  北京办公室?电话?(010)8455-4866?传真?(010)8455-4855

  技术支持热线?400-066-5835?techsupport@illumina.com?www.illumina.com.cn

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  ?2018Illumina,Inc.保留所有权利。所有商标均为Illumina公司或其各自所有者的财产。请访问www.illumina.com/company/legal.html

  获取具体商标的信息。Pub.No.770-2013-054-BQB5474

  制备文库|测序|分析数据|支持

  IlluminaSBS测序化学可提供高度准确的逐个碱基测序和对整

  个基因组的稳定覆盖。iSeq100系统体现了SBS技术的最新发

  展,它结合了CMOS传感器检测与单通道SBS技术。凭借精简

  的化学过程和光学元件、最低水平的价格和占用空间小的便利性,

  iSeq100系统能让功能强大的NGS成为几乎所有实验室的日常

  研究工具。

  了解更多

  如需了解更多有关iSeq100系统的信息,请访问

  www.illumina.com/iseq

  如需了解在iSeq100系统上进行微生物或线粒体测序的更多信

  息,请参阅使用iSeq100系统进行微生物WGS或使用iSeq100

  系统进行线粒体DNA测序应用指南

  如需了解更多有关图案化流动槽的内容,请访问图案化流动槽

  页面

  参考文献

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  HumanGenomeSequencingusingReversibleTerminatorChemistry.Nature.

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  DiseasesUsingNext-GenerationSequencing:Applications,Challenges,and

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