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知晓:运用RNA-Seq实现新一代的基因表达谱分析

发布者: 静待花开 | 发布时间: 2020-3-26 09:50| 查看数: 4| 评论数: 0 |帖子模式 |只看大图 |关灯


  目录借着行业发展的热潮,免疫研究在市场的表现力也一直很好,给用户带来很多全新的优质体验。


  新一代测序加速转录组学研究

  转录组学的动态全景

  RNA-Seq催生高影响力的论文

  RNA-Seq的经费资助和发表趋势前所未有

  RNA测序相对基因表达芯片的优势

  无假设的研究设计和更高的发现能力

  更宽的动态范围和更高的灵敏度

  检测选择性剪接位点和新型异构体以及非编码RNA的能力

  总结:RNA-Seq相对基因表达芯片的优势

  利用RNA-Seq开展基因表达研究

  什么是基因表达?它为何重要?

  RNA-Seq在基因表达中的应用

  细胞生物学和复杂疾病研究中的差异表达

  癌症研究中的非编码RNA和融合检测

  利用RNA-Seq检测新兴的病原体

  利用RNA-Seq发现生物标志物和药物通路

  Illumina的基因表达研究流程

  5

  5

  6

  8

  10

  10

  10

  11

  11

  13

  13

  14

  14

  17

  18

  20

  21

  基因调控研究和DNA甲基化

  什么是基因调控?它为何重要?

  甲基化测序和芯片的应用

  甲基化芯片用于肥胖和吸烟的表观基因组关联研究

  癌症研究中的全基因组亚硫酸氢盐测序

  复杂疾病研究中的甲基化靶向测序

  研究DNA甲基化的方法

  甲基化芯片

  全基因组亚硫酸氢盐测序

  甲基化靶向测序

  Illumina的基因调控研究流程

  Illumina的甲基化测序流程

  Illumina的甲基化芯片流程

  RNA-Seq的自动化解决方案

  NGS文库制备的进步

  微流体系统

  总结:微流体系统相对手动文库制备和传统液体工作平台的优势

  自动化液体工作平台

  结语

  了解更多

  术语表

  参考文献

  23

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  24

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  25

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  29

  30

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  31

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  33

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  34

  34

  36

  38

  40

  42

  4仅供研究使用。不得用于诊断。

  5

  新一代测序加速转录组学研究

  转录组学的动态全景

  我们对答案的好奇和追求始终是探索的驱动力。随着我们的工具已从基本的光学显微镜进化到高通量DNA测序

  仪,我们对周围世界的认识也在进化。新一代测序(NGS)以及基于NGS的RNA测序(RNA-Seq)作为最新的技术

  进步,正在推动科学家超越当前研究方法的极限。随着研究人员试图了解转录组如何塑造生物学,RNA-Seq正成

  为现代科学中最重要、最强大的工具之一。

  RNA-Seq作为一种高度灵敏且准确的基因表达分析方法,让人们看到了之前无法检测的基因表达变化,并实现

  了多种形式的非编码RNA的鉴定1,2。有了RNA-Seq,研究人员可检测转录组的精细结构,如转录异构体、基因融

  合、单核苷酸变异及其他特征,而不受现有知识的限制2,3。

  6仅供研究使用。不得用于诊断。

  RNA-Seq催生高影响力的论文

  有了这些优势,RNA-Seq正在推动研究的步伐,在多个领域催生高影响力的论文,包括癌症研究、复杂疾病和病

  毒学(图1)。在利比里亚的一项最新研究中,RNA-Seq被用来建立埃博拉病毒通过性传播的直接证据4,而在哈佛

  大学的一项免疫学研究中,单细胞RNA-Seq首次揭示了不同的免疫细胞表达相同基因的不同异构体5,这些研究

  表明了RNA-Seq正在开辟新天地。通过提供非编码转录本的视图,RNA-Seq帮助我们了解它们在复杂疾病中的

  作用6。RNA-Seq还增加了我们对农业上重要病害的了解,并提高了我们保护作物和增强育种计划的能力7,8。

  “超深度测序

  揭示了玉米种子转录组的

  近乎完整快照。”

  -SciRep,2014

  7

  “长链非编码RNA:

  细胞分化和发育中的

  新角色。”

  -NatureReviewsGenetics,2013

  “单细胞转录组分析

  揭示了重编程过程中IncRNA表达的

  动态变化。”

  -CellStemCell,2015

  “通过大规模单细胞RNA测序

  对感觉神经元进行

  偏向分类。”

  -NatureNeuroscience,2015

  “外显子-内含子环状

  RNA调控细胞核中的转录。”

  -NatureStructural&MolecularBiology,2015

  8仅供研究使用。不得用于诊断。

  RNA-Seq的经费资助和发表趋势前所未有

  随着RNA-Seq的影响力继续增长,使用RNA-Seq的研究人员数量在不断上升,基于RNA-Seq的引用次数也在不

  断增加(图1)。美国国立卫生研究院(NIH)的数据表明,基于RNA-Seq研究的论文从2008年的6篇稳步增加到

  2015年的近2300篇9。此外,NIH的数据还显示,在2009-2015年期间,RNA-Seq研究的经费每年都在稳步增加,而

  同一时期的芯片研究经费则每年都在减少(图2)。

  自从NGS推出以来,样本制备、化学方法和仪器产量方面的重大进步明显提高了数据质量、速度和经济适用性(

  图3)。这些趋势有望继续,而测序方法的进步也仍将出现,因此不久的将来,基于NGS的RNA-Seq会被赋予越来

  越多的研究设计范畴。RNA-Seq论文、引用和经费的激增,说明RNA-Seq可能正成为转录组分析的首选方法。如

  今,是时候借助新一代RNA测序的力量了。

  RNA-SeqPublications2007-2015

  200720082009

  33

  201020112012201320142015

  06

  156

  358

  631

  1122

  1720

  2297

  图1:RNA-Seq的论文在增加–包含RNA-Seq数据的论文数量从2008年的6篇增加到2015年的近2300篇9。每条柱代表了每年的引用总数。

  9

  图2:RNA-Seq的经费超过芯片的经费–与表达芯片相比,自

  2009年以来NIH对包含RNA-Seq的转录组研究计划的资助一直

  在增加10。

  图3:NGS成本的急剧下降。

  Millions

  2010200920122011201420152013

  $100

  $

  $200

  $300

  $400

  $500

  $600

  RNA-SEQ

  MICROARRAY

  RNA-Seq和芯片的经费资助

  如果2009年以来的衣食住行

  都与基因组测序的价格保持同步,

  那会怎样

  20092015

  $1500

  $1000

  $100

  $6

  (in15minutes)

  $4

  $0.40

  10仅供研究使用。不得用于诊断。

  RNA测序相对基因表达芯片的优势

  无假设的研究设计和更高的发现能力

  RNA-Seq是一种基于测序的强大方法,让研究人员能够打破传统技术的低效和花费,如实时定量PCR(RT-PCR)

  和芯片。无论是将RNA-Seq添加到现有的研究方法中,还是从一种方法彻底转换到另一种,RNA-Seq都带来了许

  多显而易见的优势。这种方法不需要预先设计的探针,因此数据集是无偏倚的,实现了无假设的实验设计2,3。这

  种类型的NGS分析对转录本和变异发现研究而言是一种有力工具,而传统的芯片方法无法实现。

  更宽的动态范围和更高的灵敏度

  芯片测定连续探针强度,而RNA-Seq不同,它对与参考序列比对的单条序列进行定量,产生了离散的(数字)读数

  2。此外,通过增加或减少测序读数(覆盖水平或覆盖深度),研究人员可以微调实验的灵敏度,以适应不同的研究

  目标。这个过程的数字化属性以及控制覆盖水平的能力支持一个非常宽的动态范围,提供绝对而不是相对的表

  达值1-3。假设有1000-5000万条定位读数,则RNA-Seq的动态范围可跨越5个数量级(>105),这通常比大多数芯片

  技术(103)高出几个数量级2,11。因此,研究表明,RNA-Seq可检测的差异表达基因比例比表达芯片更高,特别是低

  丰度的基因11,12。

  Qualitative&quantitative

  Stranded

  Highdiscoverypower

  RNAspecies

  Identifyfusions

  Absolute

  expressionlevels

  AccessnoncodingRNA

  Over10millionreads

  Singlebase-pairresolution

  Identifygenetranscripts

  Fulltranscript

  information

  Knowntranscripts

  Lowdynamicrange

  Backgroundnoise

  Relative

  expressionlevels

  Unexpectedhybridizationkinetics

  Limitedresolution

  Partial

  transcriptinformation

  图4:衡量您的选择

  11

  检测选择性剪接位点和新型异构体以及非编码RNA的能力

  除了基因表达谱分析,RNA-Seq还能鉴定选择性剪接异构体、剪接位点和等位基因特异的表达–所有这些都在单

  个实验中完成1,2。此外,RNA-Seq还能测序极短的片段,且文库制备方法可包含或排除mRNA提取,这样它就能

  检测并测序小RNA(smallRNA)及多种形式的非编码RNA,如小干扰RNA(siRNA)、microRNA(miRNA)、核仁小

  RNA(snoRNA)及转运RNA(tRNA)

  1,2。测序小片段的能力也让降解的RNA样本产生高质量的数据,如福尔马林固

  定、石蜡包埋(FFPE)样本13。随着转录组的新特征被不断发现,测序数据还可以重新分析。对于芯片,假设原始样

  本仍然可用,样本也必须重新走完整个芯片流程,从探针设计到实验室工作14。总之,RNA-Seq相对于芯片而言

  具有很多优势(表1)。它带来转录组范围的覆盖、宽的动态范围以及高灵敏度的独特组合,让研究人员能够研究

  和了解正常发育和疾病的分子机制。

  总结:RNA-Seq相对基因表达芯片的优势

  ?在转录本水平提供灵敏且准确的基因表达测定

  ?产生定性且定量的数据

  ?捕获剪接点、融合、编码及多种形式的非编码RNA,如siRNA、miRNA、snoRNA和tRNA

  ?覆盖度极宽的动态范围

  ?在降解RNA上表现出色,如FFPE组织样本

  ?在数据中保持和追踪链特异的信息

  ?为探索新的应用带来一种更强大的方法

  ?可匹配大型研究和大量样本

  表1:RNA-Seq技术与表达芯片的比较

  应用RNA-Seq芯片

  每次运行之间的重复性高

  是是

  动态范围与细胞内真正的

  转录本丰度相当

  否是

  能够检测选择性剪接位点和

  新的异构体

  否是

  无参考基因组的denovo分析否是

  可再分析数据

  否是

  12仅供研究使用。不得用于诊断。

  13

  图5:RNA-Seq带来大视界。

  利用RNA-Seq开展基因表达研究

  什么是基因表达?它为何重要?

  为了解种子如何变成花朵,或海星如何让失去的肢体再生,基因表达研究都是必需的。基因表达是指遗传蓝图转

  化成有功能的生物活性元件的过程。通常,由基因编码蛋白质,不过,科学家逐渐了解到,它们也编码大量其他的

  非蛋白编码元件,如siRNA、tRNA及多种形式的microRNA1。这一系列RNA推动了重要的生物过程,如转录调控、

  细胞分化,而在失调时,又参与了复杂疾病的发展15。RNA-Seq带来了一幅高分辨率、逐个碱基的编码和非编码

  RNA活性视图,提供了特定时刻整个转录组中基因表达的完整图像(图6)。尽管RT-PCR和表达芯片可定量表达

  水平,但RNA-Seq的主要优势在于它能够鉴定转录组的新特征。对于RT-PCR和芯片,基因组中只有已知和之前

  测序过的区域被探查。而对于RNA-Seq,包括已知和未知的区域在内的整个转录组都被捕获。

  14仅供研究使用。不得用于诊断。

  RNA-Seq在基因表达中的应用

  细胞生物学和复杂疾病研究中的差异表达

  为了解正常细胞的发育和疾病机制,研究人员常常研究发育过程中、特定组织内或不同条件下的差异表达。RNA-

  Seq被用于评估基因表达谱,以研究各种复杂疾病,包括心肌病、多发性硬化和代谢疾病16-18。最近人们对患有代

  谢异常非酒精性脂肪肝(NAFLD)个体的差异表达谱进行分析,鉴定出75个miRNA,其中30个上调,45个下调。通

  过功能分析,研究人员鉴定出重要通路中的miRNA基因目标,如生长因子β通路和凋亡通路18。

  单细胞RNA-Seq已成为干细胞、免疫学和神经生物学研究中的强大工具,可评估细胞的发育和分化19-21。单细胞

  RNA-Seq曾用在一项以鉴定和构建成年小鼠中视觉皮层细胞分类研究中。根据表达特征,不同的细胞类型被鉴定

  出49。那些检测所鉴定细胞的电生理学和轴突投射性质的研究正在进行中21。

  看看科学家现在如何在复杂疾病研究中利用RNA-Seq进行

  基因表达谱分析。

  Translationalprofilingidentifiesacascadeofdamageinitiatedinmotorneuronsandspreading

  togliainmutantSOD1-mediatedALS.ProcNatlAcadSci.2015;112:E6993-7002.

  对ALS小鼠品系SOD1的样本开展基因表达谱分析,了解肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的致病突变。研究人员发现,发病机制涉及

  到在运动神经元中发起的细胞选择性损伤的时间级联。RNA-Seq文库是用TruSeq?RNALibraryPrepKit制备的,并在HiSeq?

  系统上测序。

  Pancreatic?cellenhancersregulaterhythmictranscriptionofgenescontrollinginsulinsecretion.

  Science.2015;350:aac4250.

  为了研究细胞自主性时钟对胰腺β细胞的影响,研究人员检查了BMAL1完整表达或被破坏的小鼠的胰岛。研究人员发现,胰岛

  素分泌的振荡与编码分泌机制和胰岛素调节的基因表达同步。RNA-Seq文库是用TruSeqStrandedmRNALibraryPrepKit制

  备的,并在NextSeq?500和HiSeq系统上测序。

  Depletionoffat-residentTregcellspreventsage-associatedinsulinresistance.Nature.

  2015;528:137-41.

  研究人员开展基因表达谱比较分析,以显示贮存脂肪的调节性T细胞在脂肪组织中积累,是随着年龄而不是肥胖而变化。RNA-

  Seq文库是用TruSeqRNALibraryPrepKit制备的,并在HiSeq系统上测序。

  15

  16仅供研究使用。不得用于诊断。

  17

  癌症研究中的非编码RNA和融合检测

  RNA-Seq的一个主要优势是它带来了转录组活性的丰富视图,远远超过基本的丰度测定。有了RNA-Seq,研究

  人员能检测选择性剪接位点,鉴定非编码RNA的活性,并确定新的基因融合。对癌症研究而言,基因融合的检测

  至关重要,因为20%的人类肿瘤被发现带有易位和基因融合22。此外,人们已经确定,大多数基因融合对肿瘤发

  生有显著影响,它们与形态表型密切相关,这使其成为有潜力的诊断和预后标志物22。直到最近,绝大多数基因

  融合是通过细胞遗传学鉴定及后续的RT-PCR和Sanger测序来检测的。随着NGS技术及其鉴定基因融合能力的

  出现,每年报道的基因融合比例有可能迅速增加22,23。

  看看科学家如何在癌症研究中使用RNA-Seq技术。

  FN1-EGFgenefusionsarerecurrentincalcifyingaponeuroticfibroma.JPathol.2016;238:502-7.

  研究人员鉴定了EGF基因的过度表达是源于它与高表达的FN1启动子融合,这是几例钙化腱膜纤维瘤(CAF)的普遍情况。这

  种FN1-EGF融合似乎成为CAF的主要驱动突变。RNA-Seq文库是用TruSeqRNAAccessLibraryPrepKit制备的,并在NextSeq

  500系统上测序。

  IdentificationofanovelPARP14-TFE3genefusionfrom10-year-oldFFPEtissuebyRNA-Seq.

  GenesChromosomesCancer.2015May29.Epubaheadofprint.

  研究人员利用RNA-Seq来鉴定一份10年的FFPE组织样本中的PARP14-TFE3基因融合,这个样本是易位肾细胞癌(RCC)阳

  性的。这扩展了已知在RCC中发挥作用的TFE3基因融合数量。RNA-Seq文库是利用TruSeqRNAAccessLibraryPrepKit或

  TruSeqRNALibraryPreparationKit制备的,并在MiSeq?系统上测序。

  Genefusiondetectioninformalin-fixedparaffin-embeddedbenignfibroushistiocytomasusing

  fluorescenceinsituhybridizationandRNAsequencing.LabInvest.2015;95:1071-6.

  研究人员利用RNA-Seq来评估36个良性纤维组织细胞瘤(FH)的FFPE组织样本中PRKC基因融合的频率。他们得出结论,尽

  管PRKC基因融合存在于几种FH形态中,但融合仅出现在少数病例中。RNA-Seq文库是利用TruSeqRNAAccessLibraryPrep

  Kit制备的,并在NextSeq500系统上测序。

  18仅供研究使用。不得用于诊断。

  利用RNA-Seq检测新兴的病原体

  RNA病毒在环境中普遍存在,并引起多种人类疾病,如流感、严重急性呼吸综合征(SARS)、寨卡和埃博拉病毒病。

  尽管许多病毒性疾病可以通过有效的疫苗计划来预防,但还有很多并没有疫苗,仍造成严重的健康风险24。使用

  RNA-Seq的研究人员对调查巴西的寨卡病毒爆发和西非的埃博拉病毒疫情的研究产生了重大影响。2015年,巴西

  的小头症发病率比前几年增加了20倍以上25。2016年,巴西里约热内卢的研究人员从羊水样本中分离出病毒RNA,

  并利用RNA-Seq数据表明,寨卡病毒可穿过胎盘屏障25。这是迄今为止最强有力的直接证据,说明母体感染寨卡病

  毒和新生儿小头症之间的关联。

  2013年12月,埃博拉在几内亚出现,并在整个西非大陆迅速蔓延,成为历史上最大的埃博拉疫情26。随着埃博拉新

  病例的减少,支持工作转向关注埃博拉幸存者及其家属。当2015年的一项研究发现埃博拉病毒可通过性传播,与

  埃博拉幸存者接触的安全指南发生了明显变化4。对埃博拉病毒幸存者及其妻子的样本进行直接RNA测序,表明病

  毒可通过精液传播,而在清除幸存者血液中的病毒近200天后,病毒颗粒仍存在于精液中4。这项研究强调了埃博拉

  幸存者所在社区需要考虑的新因素。

  看看研究人员如何在流行病学和传染病领域使用RNA-Seq。

  DeterminationandtherapeuticexploitationofEbolavirusspontaneousmutationfrequency.

  JVirol.2015;90:2345-55.

  重组埃博拉病毒的超深度测序显示,尽管病毒的突变频率与其他RNA病毒相似,但是遗传多样性不同。这意味着病毒并没有

  很好地耐受遗传改变。利用这种现象,研究人员用利巴韦林治疗暴露在埃博拉病毒中的小鼠,将病毒突变率提高50%。结果

  发现,传染性病毒的生产减少,且小鼠的存活率达到75%。RNA-Seq文库是利用TruSeqRNALibraryPreparationKit制备的,

  并在MiSeq系统上测序。

  MolecularevidenceofsexualtransmissionofEbolavirus.NEnglJMed.2015;373(25):2448-54.

  埃博拉病毒的基因组是利用患者的血液样本和一名幸存者的精液样本组装的。RNA-Seq表明,埃博拉基因组有三个共同的

  替换,这在其他所有西非的埃博拉序列中不存在,并与这个病例之前记载的利比里亚传播链不同。这个证据与病毒的性传播

  一致。RNA-Seq文库是利用TruSeqRNAAccessLibraryPrepKit或TruSeqRNALibraryPreparationKit制备的,并在MiSeq

  系统上测序。

  DetectionandsequencingofZikavirusfromamnioticfluidoffetuseswithmicrocephalyinBrazil:

  acasestudy.LancetInfectDis.2016;16(6):653-60.

  研究人员利用病毒宏基因组学NGS来分析巴西2名孕妇的羊水样本,她们的胎儿被诊断出患有小头症。在这两名孕妇的羊水

  中鉴定出寨卡病毒的基因组,表明病毒可穿过胎盘屏障。RNA-Seq是利用TruSeqStrandedTotalRNALTLibraryPrepKit制

  备的,并在MiSeq系统上测序。

  19

  20仅供研究使用。不得用于诊断。

  利用RNA-Seq发现生物标志物和药物通路

  基因表达研究正在鉴定潜在的治疗性生物标志物,从而为精准医疗的发展奠定基础27。尽管表达芯片和RNA-

  Seq都能用于开发基于基因表达的预测模型,但RNA-Seq在分析低水平表达的基因时表现出卓越的能力27。此

  外,NGS分析能够以单碱基分辨率探查更多数量的遗传区域。例如,毛细管电泳在每个测序反应中能测序单个

  DNA目标区域,而每块芯片可探查多达100万条探针(Affymetrix的GeneChip)。相比之下,NGS技术可以测序

  整个转录组(如基因、基因变异和非编码转录本),而没有探针设计的限制。对于发现相关的应用或未来筛查方

  法的开发,探查整个转录组的能力带来了明显的优势28。

  在临床和转化研究领域,RNA-Seq被用来鉴定临床相关的疾病机制,发现预测性标志物,并鉴定响应的亚群。

  在诺华研究所最近开展的一项研究中,研究人员利用高通量RNA-Seq来筛查患者来源的肿瘤异种移植物,以开

  发药物反应检测的预测模型29。在这项研究中,超过1000种患者来源的肿瘤异种移植物模型被开发出来,它们

  来自各种常见的实体瘤组织,包括肝、肺、乳腺、皮肤、淋巴等。每个模型的特性是利用单核苷酸多态性(SNP)分

  析、组织学和基于RNA-Seq的表达谱分析建立的。

  看看科学家如何在生物标志物和药物通路发现研究中使用RNA-Seq。

  Transcriptomicvariationofpharmacogenesinmultiplehumantissuesandlymphoblastoidcell

  lines.PharmacogenomicsJ.2016Feb9.Epubaheadofprint.

  研究人员对389个与药物动向和作用相关的基因开展表达谱分析,这些基因来自139名个体的4种组织。他们发现表达水平和剪

  接的明显差异以及新颖的剪接事件。RNA-Seq文库是利用TruSeqRNALibraryPrepKit制备的,并在HiSeq2000系统上测序。

  SerummiRNApanelaspotentialbiomarkersforchronichepatitisBwithpersistentlynormal

  alanineaminotransferase.ClinChimActa.2015;451:232-9.

  研究人员对循环miRNA进行测序,发现了新的miRNA生物标志物,并建立了具有临床价值的准确miRNA检测板,适用于所有

  肝炎患者的诊断。RNA文库是利用TruSeqSmallRNALibraryPrepKit制备的,并在HiSeq2000系统上测序。

  TheidentificationofcirculatingmiRNAinbovineserumandtheirpotentialasnovelbiomarkersof

  earlymycobacteriumaviumparatuberculosisinfection.PLoSOne.2015;10:e0134310.

  研究人员对牛开展RNA-Seq,以分析循环miRNA。他们发现了新的生物标志物,有望用于分枝杆菌感染的早期诊断,这种细菌

  可引起Johne’sDisease,造成牛群的损失。RNA文库是利用TruSeqSmallRNALibraryPrepKit制备的,并在HiSeq2500系统

  上测序。

  21

  2

  1

  3

  制备文库

  2

  1

  3比对/计数

  2

  1

  3

  测序

  ?TruSeqStrandedTotalRNALibrary

  PrepKitwithRibo-Zero(人类、老鼠、

  家鼠、植物、黄金)

  ?TruSeqstrandedmRNAlibraryPrep

  KitwithRiboZero(流行病学、细菌、

  酵母)

  ?使用RNAExpressApp(BaseSpace

  InformaticsSuite)

  ?使用TopHatAlignmentApp。将RNA-

  Seq序列与STARaligner比对,将比对

  好的序列分配到基因

  ?使用DESec2开展差异基因表达分析

  ?NextSeq系列(3-10个样本)

  ?HiSeq系列(9-90个样本)

  Illumina的基因表达研究流程

  Illumina提供了从RNA到数据的全面整合流程,从最初的文库制备到最终的数据分析。Illumina提供多种文库制

  备试剂盒,适合广泛的RNA-Seq应用,包括总RNA-Seq、mRNA-Seq、小RNA-Seq、低质量样本及其他。

  22仅供研究使用。不得用于诊断。

  23

  基因调控研究与DNA甲基化

  什么是基因调控?它为何重要?

  基因表达的调控是一个生物学过程,它控制着基因产物的时间和空间表达,包括mRNA和非编码RNA转录本。

  人们采用各种机制来提高或降低基因表达,包括让调控蛋白与DNAmotif结合,让RNA聚合酶与调控元件结合,

  以及对组蛋白染色质结构的调控30。确定蛋白质-DNA的相互作用如何调控基因表达,对全面了解许多生物过程

  和疾病状态至关重要31。染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)可以利用NGS来高效确定与DNA结合的蛋白目标在

  基因组中的分布和丰度,且分辨率达到碱基对水平32。

  胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的DNA甲基化也发挥了重要作用,将遗传密码的工作与不断变化的环境因素相

  关联。它让细胞能获得并维持一种特化的状态,并抑制病毒和非宿主DNA元件的表达。

  异常的DNA甲基化及其对基因表达的影响已经与许多疾病过程相关,包括癌症、神经系统疾病、衰老和发育33,34。

  高通量技术,如全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)、靶向亚硫酸氢盐测序和甲基化芯片,是研究基因组内动态的

  DNA甲基化的强大工具。这些表观遗传信息与DNA测序、基因分型、基因表达以及其他形式的整合基因组分析高

  度互补。最近一项发表在《NatureMethods》上的研究报道了61种鼠干细胞的转录和表观遗传甲基化分析,并发

  现了许多之前不了解的甲基化调控元件和重要多能基因转录之间的关联35。

  24仅供研究使用。不得用于诊断。

  甲基化测序和芯片的应用

  甲基化芯片用于肥胖和吸烟的表观基因组关联研究(EWAS)

  在过去十年,研究人员已经发现行为表观遗传因素(如饮食、吸烟和锻炼)与复杂疾病(包括肥胖和心脏病)之间

  的明显关联36,37。由于肥胖和吸烟是合并症的主要风险因素,如癌症、心血管疾病和代谢疾病,并且这些复杂疾

  病不能仅仅通过遗传学来了解,于是研究人员进一步深入表观遗传机制36。甲基化芯片技术的进步正对表观遗

  传学领域产生重大影响,让研究人员能够对大的样本队列开展经济的全基因组甲基化研究。最近使用Infinium

  HumanMethylation450BeadChip芯片的研究表明,吸烟不仅改变成年吸烟者的甲基化图谱,还改变那些母亲

  在怀孕期间吸烟的新生儿的甲基化图谱38,39。另一组研究则使用同样的HumanMethylation450BeadChip芯片

  来研究肥胖的表观遗传影响。DavidGeffen医学院的研究人员发现,肥胖加速人类肝脏组织的表观遗传衰老,而

  佐治亚预防研究所的科学家发现,甲基化差异的位点所在的区域与之前的GWAS研究相对应,那些研究已经在

  肥胖受试者中鉴定出与高血压、血脂异常和2型糖尿病相关的基因40,41。

  25

  癌症研究中的全基因组亚硫酸氢盐测序

  在过去十年,人们已经逐渐认识到,表观遗传学改变是癌症发生和发展的重要驱动因素42-44。全基因组亚硫酸氢

  盐测序(WGBS)实现了正常细胞和癌细胞中全基因组的甲基化模式定位,并且拓宽了我们对甲基化模式改变所

  影响的分子机制的认识。这些机制包括超甲基化、基因沉默和染色质重塑。

  正常和肿瘤基因组的全基因组甲基化定位已经确认,几乎所有类型的癌症都带有数十至数百个基因,它们的

  DNA甲基化异常增加43,44。研究发现,CpG超甲基化会沉默DNA修复基因、下调肿瘤抑制基因,并破坏microRNA

  对致癌目标的调控45-47。每年,描绘表观遗传改变如何驱动癌症发生和发展的新研究都在不断涌现。这些见解带

  来了丰富的资源,有望发掘出有潜力的癌症生物标志物和治疗机会。

  看看科学家如何在肥胖和吸烟的EWAS研究中使用甲基化芯片。

  Methylomicagingasawindowintotheinfluenceoflifestyle:tobaccoandalcoholusealterthe

  rateofbiologicalaging.JAmGeriatrSoc.2015;63(12):2519-2525.

  研究人员对之前与衰老相关联的71个位点以及与香烟和酒精消耗相关的位点开展表观遗传图谱分析。他们发现,尽管酒精对

  衰老有不同的影响,但吸烟在各个层面都有强烈的负面影响。甲基化状态是利用InfiniumHumanMethylation450BeadChip

  Kit探查的。

  Presenceofanepigeneticsignatureofprenatalcigarettesmokeexposureinchildhood.Environ

  Res.2016;144(PtA):139-48.

  研究人员对之前与产前吸烟暴露相关的26个位点开展表观遗传图谱分析。他们发现,这种表观遗传特征在儿童血液样本中可

  检测到,并且可用于测定暴露。全基因组甲基化是利用InfiniumHumanMethylation450BeadChipKit测定的。

  Epigenome-wideassociationstudy(EWAS)ofBMI,BMIchange,andwaistcircumferencein

  AfricanAmericanadultsidentifiesmultiplereplicatedloci.HumMolGenet.2015;24(15):4464-79

  研究人员对与肥胖增加相关的位点进行表观遗传图谱分析。他们发现,甲基化状态与肥胖的身体标志物之间存在关联。这些

  样本的全基因组甲基化是利用InfiniumHumanMethylation450BeadChipKit测定的。

  26仅供研究使用。不得用于诊断。

  复杂疾病研究中的甲基化靶向测序

  自闭症、糖尿病和肌营养不良等疾病是复杂的多基因疾病,具有数百个易感基因位点。而外部因素(如环境、饮食

  和锻炼)与遗传结构相互作用,介导了疾病发展,这为我们了解复杂疾病又增添了一重挑战48。与WGBS相比,甲

  基化靶向测序提供了一种经济的方法,适用于探查感兴趣的特定DNA区域。这些感兴趣的区域也能以高的深度

  进行测序。

  研究发现,表观遗传机制在神经发育疾病中发挥重要作用,如自闭症和Rett综合征48。最近一项发表在

  《MolecularPsychiatry》上的研究报道了单卵双胞胎的分析,其中一人患有自闭症而另一人未患病,说明DNA

  甲基化与自闭症性状评分之间的显著相关性49。代谢障碍也受到遗传和环境因素之间的复杂相互作用的影响。

  例如,非酒精性脂肪肝(NAFLD)是一种与肥胖和2型糖尿病强烈相关的疾病,它也受到热量摄入及遗传倾向的

  影响50。甲基化靶向测序提供了一种平衡且经济的选择,可支持筛选和变异发现应用,从而推进复杂疾病研究的

  突破。

  看看科学家如何在他们的研究中使用WGBS。

  TransientacquisitionofpluripotencyduringsomaticcelltransdifferentiationwithiPSC

  reprogrammingfactors.NatBiotechnol.2015;33:769-74.

  利用WGBS,研究人员发现,通过OSKM诱导的转分化从小鼠成纤维细胞中获得的绝大多数重编程心肌细胞或神经干细胞都

  经历了一个瞬时的多能状态。WGBS文库是利用EpiGenome/TruSeqDNAMethylationKit制备的,并在HiSeq系统上测序。

  Single-cellDNAmethylomesequencingandbioinformaticinferenceofepigenomiccell-state

  dynamics.CellRep.2015;10:1386-97.

  这项研究介绍了一种WGBS检测,适用于少量细胞或单细胞的DNA甲基化定位。这种方法让各种生物系统的单细胞DNA甲基

  化分析成为可能,包括干细胞分化和癌症。WGBS文库是利用EpiGenome/TruSeqDNAMethylationKit制备的,并在HiSeq

  系统上测序。

  TheDNAmethylationlandscapeofChinesehamsterovary(CHO)DP-12cells.JBiotechnol.

  2015;199:38-46.

  利用WGBS和基因表达分析,研究人员证明CHODP-12细胞表现出与癌细胞和胎盘细胞相似的表观基因组图谱,并且这些特征

  可能参与了组织特异基因的抑制。WGBS文库是利用EpiGenome/TruSeqDNAMethylationKit制备的,并在HiSeq系统上测序。

  27

  看看科学家如何在复杂疾病研究中使用NGS甲基化靶向测序。

  LactasenonpersistenceisdirectedbyDNAvariation-dependentepigeneticaging.

  NatStructMolBiol.2016;23(6):566-73.

  研究人员对小鼠和人小肠中的LCT和MCM6位点开展靶向的亚硫酸氢盐测序。他们发现,受到表观遗传控制的调控元件解释了

  乳糖酶mRNA水平的差异。文库是利用亚硫酸氢盐锁式探针技术制备的,并在HiSeq2500系统上测序。

  BrainfeminizationrequiresactiverepressionofmasculinizationviaDNAmethylation.

  NatNeurosci.2015;18:690-7.

  研究人员测定了雄性、雌性和雄性化雌性小鼠的视前区性二态核(POA)中的基因表达和DNA甲基化。他们发现,激素介导的DNA

  甲基化的活性降低导致POA的雄性化。亚硫酸氢盐文库在Illumina的HiSeq系统上测序。

  Comparisonofmethyl-capturesequencingvs.Infinium450Kmethylationarrayformethylome

  analysisinclinicalsamples.Epigenetics.2016;11:36-48.

  研究人员根据覆盖度、技术差异以及临床样本中甲基化检出的一致性,对靶向测序和InfiniumHumanMethylation450

  BeadChip芯片进行评估和比较。靶向Methyl-Seq文库在Illumina的HiSeq系统上测序。

  28仅供研究使用。不得用于诊断。

  研究DNA甲基化的方法

  人们逐渐意识到,DNA甲基化是正常生理以及许多疾病的发展过程中的关键因素。研究表明,甲基化状态在癌

  症、肥胖、糖尿病等疾病中起作用34,51,52。芯片分析和NGS都能用来研究DNA甲基化对发育和疾病的影响,具体要

  取决于研究的目标和规模。

  甲基化芯片

  复杂疾病受到遗传和环境因素的综合影响。全基因组关联研究(GWAS)在鉴定与多种疾病有关的遗传变异中发

  挥关键作用53。DNA甲基化芯片的出现推动了EWAS的成功,使得人们阐明疾病的新分子机制,鉴定出有潜力的

  治疗标志物54。尽管十年前进入市场的首批DNA甲基化芯片只有不到30K的CpG位点,但现有的芯片可探查基因

  组内超过850K的CpG位点(图6)

  55,58-60。由于每个样本的成本低,甲基化芯片成为EWAS及其他大样本量研究的

  首选。

  2007

  27kArray

  ?市场上第一款

  EWAS芯片产品

  2010

  450kArray

  ?新技术,300美元/样品

  ?1000多篇文献

  ?关注基因主体和启动子

  ?催生EWAS研究

  2015

  EPICArray

  ?同样值得信赖的技术,

  850多个标记的

  全新内容

  ?330美元/样品

  ?添加增强子区域

  (由ENCODE、

  FANTOM5鉴定出)

  ?90%以上的内容

  向后与450K兼容

  Illumina甲基化芯片的进步

  图6:甲基化芯片的进步–在过去十年,甲基化芯片经过发展,包含了更多的内容和更广泛的表观遗传区域类型。

  29

  全基因组亚硫酸氢盐测序

  WGBS借助新一代测序的力量来全面查看基因组内的甲基化模式。WGBS依赖DNA的亚硫酸氢盐转化来检测未

  甲基化的胞嘧啶。在文库制备过程中,亚硫酸氢盐将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。在测序数据中,经过转化

  的碱基被识别为胸腺嘧啶,而读取计数可用来确定甲基化胞嘧啶的比例。基于NGS的WGBS让研究人员能够以

  单碱基的分辨率发现CpG(胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸)、CHH(H代表腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶)和CHG区域的甲

  基化模式。因此,与甲基化芯片或靶向亚硫酸氢盐测序等甲基化检测方法相比,WGBS为探索性应用带来了最强

  大且最全面的方法。

  甲基化靶向测序

  第三种逐渐被采用的方法是甲基化靶向测序。在这种靶向方法中,亚硫酸氢盐转化之后是通过PCR扩增感兴趣的

  特定区域,接着进行测序。由于只有靶向区域被测序,故每个样本的成本比WGBS低。甲基化靶向测序方法只测序

  一部分基因组,因此与WGBS相比,它产生了更容易管理的数据集和更快的测序流程。甲基化靶向测序的一个主要

  好处是它带来了介于WGBS和甲基化芯片之间的既平衡又经济的选择,可支持筛选和变异发现的研究目标。甲基

  化靶向测序特别适合感兴趣区域的假说检验研究,以及EWAS或GWAS研究所发现区域的验证56。

  每个样品的总价*

  芯片方案?经济高效

  大规模筛选

  每个样品的成本低

  MethylationEPIC

  450K的

  核心内容+增强子内容

  TruSeqMethylCapture

  更高密度的

  EPIC内容、低成本、快速

  验证关键的样品

  或

  大规模筛选

  TruSeqDNA

  Methylation

  全基因组

  亚硫酸氢盐测序

  (WGBS)

  2M5M20M50M1M500K

  #CpG位点的数量

  测序方案?深入研究

  图7:不同的甲基化方法–基因组中甲基化模式的检测可以通过许多不同方法来开展,支持与探索相关和/或与筛选相关的研究目标。

  *包括文库制备、测序仪价格、索引、亚硫酸氢盐转化和富集试剂。

  30仅供研究使用。不得用于诊断。

  Illumina基因调控研究的流程

  Illumina甲基化测序流程

  从文库制备到最终的数据分析,Illumina为WGBS提供了一个全面优化且整合的流程。

  2

  1

  3

  制备文库

  2

  1

  3比对/计数

  2

  1

  3

  测序

  ?TruSeqDNAMethylationKit

  ?MethylSeqApp–将亚硫酸氢盐处理后的

  测序读取定位到感兴趣的基因组,并利用

  Bismark算法开展甲基化检出。Bowtie2,

  一种超快的高效记忆工具,将读取与长的

  参考序列比对。

  ?MethylKitApp–开展差异甲基化分析。

  ?BaseSpaceDataRepository–查看利用

  TruSeqDNAMethylationKit和Illumina测

  序仪产生的WGBS数据示例(使用“Methyl-

  Seq”类别过滤器)。

  ?NextSeq系列

  (0.5个WGBS样本/流动槽)

  ?HiSeq2500系统

  (2个WGBS样本/流动槽)

  ?HiSeq3000/4000系统

  (2-3个WGBS样本/流动槽)

  31

  Illumina的甲基化芯片流程

  从最初的芯片杂交到芯片扫描再到最终的数据分析,Illumina为使用甲基化芯片的表观基因组学研究提供了一

  个全面且完整的流程。

  2

  1

  3

  制备样本

  2

  1

  3分析

  2

  1

  3

  扫描

  ?MethylationEPICBeadChip–无需

  PCR,样本起始量低(低至250ng),

  试剂盒使用InfiniumI和InfiniumII

  检测技术。

  ?GenomeStudio软件和Methylation

  Module–开展差异甲基化分析,显

  示染色体坐标、GC百分比、CpG岛的

  位置和甲基化B值。

  ?iScan?System–支持高通量的

  BeadChip芯片处理,快速准确

  地扫描成百上千个样本

  32仅供研究使用。不得用于诊断。

  33

  RNA-Seq的自动化解决方案

  NGS文库制备的进步

  尽管NGS和RNA-Seq打开了通往振奋人心的研究新突破的大门,但每个成功的测序运行仍然离不开一个同样成

  功的文库制备。RNA-Seq的文库制备可能是耗时的,并且可能成为测序流程的瓶颈,这主要取决于所使用的方法

  和所需的测序规模。自动化工具将对此有所帮助,它们能尽量减少人为失误,缩短手工操作时间,并实现更高的

  通量。以前,只有资金充足的实验室才能够将其文库制备操作自动化。但随着NGS研究的不断增多,自动化文库

  制备方案的数量和种类也在扩大。

  34仅供研究使用。不得用于诊断。

  微流体系统

  微流体系统通常利用机械力、电力或磁力来处理体积很小的液体(通常为纳升至皮升)。它们满足不同的通量范

  围,从低到高(这取决于应用和平台)。一些系统专门用于一种类型的应用或适用面狭窄;而其他系统则更灵活,

  适合更广泛的应用。多个微流体系统可以一起工作,实现更大量的处理以及低至中等的资金投入。微流体系统相

  对手动文库制备而言具有明显的优势,且资金投入比大多数传统的液体处理器更低57。

  总结:微流体系统相对手动文库制备和传统液体处理器的优势

  ?手工操作时间缩短

  ?重复性高

  ?人为失误的几率降低

  ?样本起始量低

  ?通过7x24的文库制备减少操作瓶颈

  自动化液体处理器

  自动化液体处理系统是功能强大、应用灵活的系统,可以满足高通量样本处理中的最大需求。液体处理系统可编

  写各种操作方案,允许研究人员灵活调整实验条件。就样本通量而言,自动化液体处理系统带来了最高的性能,

  但也需要最大的资本投入。尽管液体处理系统的重复性更高、手工操作时间缩短,且人为失误减少,但伴随而来

  的挑战通常包括大量的资本投入、更高的运营费用,以及更长的人员培训时间。

  不再有限制:重新思考自动化能力。

  自动化已经发展到了这样一种程度:我们应不再去假设某些应用只能使用某些类型的自动化文库制备

  技术。以RNA-Seq为例,过去微流体并不被认为是RNA-Seq文库制备的一种选择,但如今它是。对于微流

  体和自动化平台,当今的样本制备试剂盒更加简单、更加自动化友好,让研究人员和临床医生能够尽可

  能扩展它的应用范围。

  35

  使用微流体系统

  25-250ng

  手动操作

  100-2000ng

  减少起始量

  让起始量降低85%

  图8:微流体系统降低了DNA起始量需求

  看看当今的科学家如何利用NGS的自动化方案。

  在线研讨会–NeoPrep?系统用于斯德哥尔摩SciLifeLab的RNA-Seq

  SciLifeLab的MaxK?ller博士介绍了如何利用NeoPrep系统开展低起始量样本的TruSeqmRNA文库制备。数

  据比较了在NeoPrep系统和液体处理器上制备的文库,显示自动化平台的等效性和重现性。

  36仅供研究使用。不得用于诊断。

  结语

  在过去十年,基因组学和转录组学的进步使得人们更好地理解复杂疾病、癌症生物学,以及环境对人类健康的影

  响。NGS的能力让转录组学的范围从每次探查几个基因扩大到在单次实验中分析全基因组的表达水平。EWAS

  通过另一个层面的信息支持这些发现,它说明了甲基化状态以及对环境线索的遗传反应。事实上,基因组学革命

  最令人兴奋的一个方面是能够以前所未有的速度和前所未有的规模将转录、表观遗传和遗传研究整合成一个综

  合的观点。

  尽管NGS的出现带来了很多进步,但仍有更多需要去探索和发现。结合广泛的文库制备产品组合、高质量数据以

  及用户友好的分析应用程序,Illumina的RNA-Seq解决方案让研究人员有能力去调查人类健康和疾病的分子机

  制。自从2006年推出第一台测序系统以来,Illumina一直致力于通过不断创新来加快研究的步伐。与世界各地的

  科学家合作,Illumina希望借助NGS的力量来更深入了解人类生物学,并让子孙后代有望实现先进的精准医疗。

  37

  38仅供研究使用。不得用于诊断。

  了解更多

  我该如何着手开展RNA-Seq?

  在开始计划您的RNA-Seq实验时,可利用以下资源:

  ?Buyer’sGuide:SimpleRNA-SeqWorkflows

  ?Buyer’sGuide:NGSSystems

  ?FAQs:RNA-SeqDataAnalysis

  ?ToolsibraryPrepKitSelector

  ?NeoPrepLibraryPrepSystem

  如果在测序运行或数据分析过程中需要帮助,我该怎么办?

  无论您是遇到基本的数据分析问题,需要立即关注;还是遇到高级问题,需要深度咨询,Illumina都能提供帮助。

  除了即时的电话和电子邮件支持,Illumina的客服和支持团队还提供了一整套便利的解决方案,从最初的培训,

  到仪器支持、个性化咨询和持续的NGS培训。Illumina客户支持产品包括:

  Illumina技术支持

  美洲、欧洲和亚太地区提供全球、24小时x5天的电话和电子邮件支持

  Illumina的技术支持专家可通过GoToAssist执行桌面共享,这是一个强大的工具,通过电话和实时桌面共享可

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  例的技术支持专家。

  39

  Illumina大学培训

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  Illumina咨询服务

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  ?安装认证(IQ)、操作认证(OQ)和性能认证(PQ)

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  (北美)或1.858.202.4566(北美以外地区),立即规划您的RNA-Seq实验。

  40仅供研究使用。不得用于诊断。

  术语表

  覆盖水平:与参考DNA的每个碱基对齐的测序碱基的平均数量。例如,以30x覆盖度测序的全基因组意味着,平

  均来说,基因组中的每个碱基被测序30次。

  深度测序:覆盖水平高的测序。例如,WGS通常是以30x-75x的覆盖度开展的,而靶向NGS实现了5000x甚至更高

  的测序深度。

  发现能力:基因组学中指的是鉴定新型变异的能力。

  微流体:一种处理小体积流体的技术。对于文库制备,这是一类自动化系统,能够满足从低到高的不同通量需求,

  具体取决于应用和平台。它带来了高水平的一致性,与手动方法相比需要的步骤和手工操作时间更少。

  多重检测:将独特的DNA序列与测序文库中的片段相连接的过程,便于下游的计算机分类和识别。索引通常是接

  头或PCR引物中的组分,在测序文库的制备阶段与文库片段相连接。Illumina的索引通常为8-12bp。带有独特索

  引的文库可以混合在一起,上样到测序流动槽的一个通道中,并在同一运行中测序。之后通过生物信息学软件可

  识别序列并分类。

  突变分辨率:技术能够检测的突变量,以碱基对为单位。例如,核型分析提供了5-10Mb的突变分辨率,而比较基

  因组杂交芯片提供了“更高的分辨率”,可以检测低至50kb的突变。NGS技术则提供了最高的突变分辨率,因为

  它们能够实现单碱基对的变异检测(检测突变的存在)和核苷酸鉴定(检测突变的身份)。

  新一代测序(NGS):一种不是基于Sanger的高通量DNA测序技术。与Sanger测序相比,NGS平台对多达数十亿

  条DNA链进行平行测序,使得通量大幅提高,且不大需要使用Sanger测序中常用的片段克隆方法。

  双端读取:一种涉及到两个不同区域测序的策略,这两个区域在同一DNA片段上彼此分开。这种策略带来了更高

  的物理覆盖,并缓解了NGS平台的几个限制,这是因为它们的读长相对较短。

  实时定量聚合酶链式反应(qPCR):一种能够测定样本中核酸量的应用。用聚合酶扩增感兴趣的核酸,并实时测

  定PCR循环过程中扩增产物积累的水平。这些数据可用于推断核酸的起始量。

  读取:一般来说,序列“读取”指的是与DNA样本相对应的A、T、C和G数据串。在Illumina的技术中,单次测序运

  行产生数百万个读取。更具体地说,流动槽上的每个簇产生单条测序读取。例如,流动槽上的10,000个簇将产生

  10,000条单端读取和20,000条双端读取。

  逆转录PCR(RT-PCR):一种利用qPCR测定RNA表达水平的应用。通过逆转录酶,RNA起始材料被逆转录成互补

  DNA(cDNA)。表达水平通常是以相对值表示的,相对于参考基因的表达。

  41

  自动化液体处理:一个机器人将指定数量的试剂、样本或其他液体分配到指定的容器。与手动方法相比带来了一

  致性和准确性;通常用于大量样本。灵活的选择,适用于对所开展的应用缺乏预测性的实验室。

  Sanger测序:这种测序方法也称为毛细管电泳测序,在1977年由FrederickSanger开发。它是在DNA体外复制

  过程中通过DNA聚合酶选择性掺入链终止的双脱氧核苷酸来测序DNA。

  灵敏度:基因组学中指的是检测低频率变异或低丰度转录本的能力。

  边合成边测序(SBS):这种技术利用4种荧光标记的核苷酸对流动槽表面的数千万个簇进行平行测序。在每

  个测序循环中,单个标记的dNTP被添加到核苷酸链中。核苷酸标记作为聚合的“可逆终止子”:在dNTP掺入

  后,荧光染料可通过激光激发和成像来识别,然后用酶切除,以便下一轮的掺入。由于4种与可逆终止子结合的

  dNTP(A、C、T和G)都存在,天然竞争使得掺入偏向最小化。碱基检出是直接通过每个循环的信号强度测定来完

  成的,与其他技术相比大大降低了原始错误率。其结果是高度准确的碱基逐个测序,消除了序列背景特异的错

  误,实现了整个基因组内可靠的碱基检出,包括重复序列区域和均聚物。

  测序集合:一组被特定研究领域确定为感兴趣区域的基因或目标区域。

  目标区域:基因组中一段被确定为感兴趣区域的特定序列,这可能是由于参与或关联到生物发育、发病机理,或

  研究人员感兴趣的其他研究领域。这段序列可以是基因、基因片段、基因融合、启动子区,内含子或外显子的一部

  分,或研究人员感兴趣的任何序列片段。

  靶向测序:在测序之前,一组基因或基因组区域被分离出并选择性富集或扩增。使用NGS的靶向方法让研究人员

  能够将时间、费用和数据分析集中在感兴趣的特定区域。这种靶向分析包括外显子组(基因组的蛋白编码部分)、

  感兴趣的特定基因(定制内容),以及基因或线粒体DNA中的目标。

  42仅供研究使用。不得用于诊断。

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