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谈一谈基于测序的基因分型

发布者: 静待花开 | 发布时间: 2020-3-25 22:45| 查看数: 10| 评论数: 0 |帖子模式 |只看大图 |关灯


  简介除了国内,靶向重测序在国际领域也崭露头角逐渐的受到更多外国友人的青睐。


  如今的农业基因组学研究人员可选择多种技术来搜集遗传信息。

  基于芯片的SNP筛查方法一直是分析多个动植物的基因组区域并

  将其与性状相关联的首选方法。随着测序成本的不断下降,利用新

  一代测序(NGS)技术的新方法也被开发出来,以开展基因分型研

  究。我们使用基于新一代测序的基因分型(NGG)这个术语来涵盖

  利用NGS技术的基因分型方法。NGG包括了目标片段测序,降低代

  表性的文库测序和基于杂交的方法,以便发现SNP和基因分型,这

  些往往同时用于许多个体或样本。本篇应用聚焦深入探讨了不同的

  NGG方法,它们的优势,以及传统芯片技术在未来将扮演的角色。

  芯片为农业基因组学的基因分型铺平道路

  在1980年代后期,研究人员开始鉴定某些物种中的特定DNA区域,

  这些区域影响了表型性状。他们的努力很快换来了准确且经济高

  效的遗传检测的开发,这些检测可确定样本中这些区域的基因型。

  用户友好的PCR型标记,如短串联重复片段(STR或SSR),最终被这

  些基因分型研究所选择的单核苷酸多态性(SNP)所取代。SNP不

  仅以高丰度存在于基因组中,而且在特定群体的高密度筛查时,它

  们也能够高效追踪遗传区域从父母到子女的转移。如今,基于SNP

  的分析已常规用于鉴定性状–标记关联,开展基因组选择、亲子鉴

  定和分子标记辅助育种。

  1

  优化标记密度以检测性状关联是开发基因分型工具时的主

  要挑战之一。性状关联依靠重组单元(单倍型区块)的检测,

  这让优化定向“多样性群体”的标记密度变得很关键,这样才能以

  合理的成本对每个样本开展基因分型。

  打造可靠的基因分型芯片涉及到多个关键步骤,包括最初的SNP

  发现、多样性评估以及SNP选择。

  2–3之后,将经过过滤的一组高质量

  SNP布置在高密度基因分型平台上,如Infinium?分析。每个样本的

  成本通常限制了SNP芯片在科研应用中的使用,因筛查群体很小。

  然而,对多个农业应用而言,基因分型能带来深远的好处,包括育

  种群体的筛查。

  4通过遗传筛查,农民和家畜饲养者可以立即获得反

  馈,以便做出更好的育种决定,并加速他们的投资回报(ROI)。每个

  样本成本较低的基因分型工具使得在大规模群体上开展常规遗传

  筛查成为可能,而具有吸引力的ROI也抵消了技术的实施成本。

  测序进展可带来更经济高效的基因分型

  测序技术的快速发展带来了更高的通量和每个样本的更低成本,

  这使得NGG成为一种经济高效的农业基因组学工具,适合基因型

  筛查、遗传作图、纯度检测、回交系筛查、单体型图谱构建以及关联

  作图和基因组选择的开展。

  5–7NGG方法还在不断增多,每一种都带

  来了测序的基本好处,包括降低偏好性,除SNP之外的变异(小的插

  入、缺失和微卫星)的鉴定,以及在缺乏参考基因组时开展样本间

  比较分析的能力(表1)。

  基于测序的基因分型方法

  对于小型基因组(如果蝇)或关注度高的研究物种(如拟南芥),基

  因分型和变异筛查可以利用对比参考序列的标准全基因组测序

  (WGS)方法来完成。对于资金有限的大型基因组研究,基于测序

  的基因分型(或NGG)方法已被开发出来。

  对于操作成本低于WGS的方法而言,NGG的进步最为明显。较低成

  本操作的开发主要是由农作物研究人员推动的,这支持了基因组

  学辅助育种和基因组选择中的应用。

  8–9

  浅层测序

  小麦染色体的研究已证实,低覆盖度或可扩展/调整的浅层测序在

  SNP发现中很有效,有助于详细的多样性分析、分子标记辅助育种

  和基于测序的基因分型。

  12–13它具有很多优势,包括确定的样本制

  备步骤和信息学应用程序分析流程,无需与参考比较而检出read

  中的SNP,以及最大限度避免假阳性的冗余检查(SGSAutoSNP)。

  12

  通过重新运行样本,还能利用浅层测序调节产生的数据量,从而增

  加序列覆盖度,避免文库制备的优化和样本追踪的挑战。

  富集

  通过PCR或杂交探针的使用,目前有一系列方法可分离特定的基因

  组片段用于随后的测序,这些方法要么去除不想要的组分(目标富

  集,图1A),要么选择想要的目标(定向pulldown,图1B)。

  14–15。它们

  致力于目的区域的测序,提供足够的测序覆盖重叠,以便可靠地检

  出SNP。尤其在植物中,这些方法避免将测序空间浪费在重复区域

  或其他不想要的基因组区域上。

  14

  基于测序的基因分型

  让农业基因组学面临关键抉择

  对于某些应用而言,基于测序的基因分型在开展遗传变异研究时提供了比芯片成本更低的选择

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  应用聚焦:农业基因组学

  基于PCR的方法

  目前已有多种基于PCR的基因分型方法被开发出来,包括PCR扩

  增子的直接测序,长距离PCR测序(其中片段在文库制备中已打

  断),以及分子倒置探针的使用,它们靶定在扩增之前用连接酶环

  化的长片段区域。这些方法为扩展标记和样本多重分析(每个流

  动槽或通道中多个样本)带来了挑战,多重分析旨在利用NGS的通

  量,从而最大限度降低成本。其他挑战还包括准确优化多重反应的

  条件,以便均一地捕获所有目标区域。

  14,16现在已有多个商业化的

  PCR方法有助于实现最佳的多重反应条件,包括IlluminaTruSeq?

  CustomAmplicon。

  基于杂交的方法

  基于杂交的方法包括固相基质以及液相杂交方法,利用寡核苷酸

  特异性与互补序列结合并分离。为了充分利用测序能力并优化成

  本,这些方法依靠用同一探针组富集的多重样本。固相杂交在样本

  制备后完成,其中已杂交的基因组区域保留,而未杂交的区域被洗

  掉。更常用的液相杂交方法一般利用生物素标记的探针或RNA诱饵

  来捕获目标。杂交捕获在异源四倍体的基因分型中有优势,因为它

  能够区分同源基因组。

  17

  目标富集

  目标富集方法是模式基因组(如牛或水稻)的理想选择,这些基因

  组的目标区域序列已知,如功能丧失标记或分子标记辅助育种中

  所用的性状关联。它们是SNP发现和重组断裂点精细作图的强大方

  法。例如,研究小麦的研究人员利用序列捕获分析对2.2Mb的外显

  子区域进行定向重测序,鉴定出4,000个SNP和129个插入缺失,可

  区分培育和野生的小麦。

  17

  基于测序的基因分型方法一直在发展,这主要是由降低成本的需

  求所推动。因此,随着更多基因组被拼接好并成为参考,经济高效

  的目标富集方法将越来越重要,让研究人员能够选择他们感兴趣

  的标记。

  限制性酶方法:RE-GBS、RAD-Seq和ddRADSeq

  NGG经济性上的最大进步是利用限制性酶方法来实现的,它们降

  低了后续测序的文库的代表性。限制性酶GBS(RE-GBS)、限制性位

  点关联测序(RAD-Seq)以及ddRADSeq方法利用限制性酶来产生

  测序片段。他们带来了全基因组代表性的少量数据,这些数据可比

  对、比较并筛查,从而发现SNP变异(图1C)。

  5、8、9、20NGS兼容的片段

  文库实现了大规模并行且多重的样本测序,有助于在大规模群体

  中快速发现并对数千个SNP进行基因分型。

  RE-GBS的方案最初是在农作物(如玉米和小麦)中建立的,有着成

  本上的优势,也适合应用在无基因组背景知识的物种上。RE-GBS特

  别适合群体或亲缘关系相近样本的作图,如基因组选择的候选区

  域。如果群体比预想中更为分散或是新物种,则RE-GBS方案需要优

  化,以便自定义覆盖度,并最大限度减少丢失的数据。例如,目标样

  本的高分散度可能导致数据丢失,下游分析复杂化,而低分散度可

  导致检测到的SNP数量较少。

  RE-GBS的优点很多,因此开发物种特异应用的方案是值得的。

  8与

  芯片方法相比的确认偏好减少,能够同时发现和确定多态性,且每

  个样本能够以低成本产生宝贵的遗传信息(<20美元,不包括生物

  表1:测序法基因分型的好处和考虑因素

  相对于芯片法基因分型的

  好处

  解释考虑因素

  基因分型成本低(现在)

  NGG方法通常使用自制的样本制备和多重分析。

  每个样本的成本低于20美元。

  ?低多样性的群体(如棉花)将比高多样性的群体(如玉米)表现出更少的多态

  性。因此,对低多样性物种而言,每个数据点的成本将较高。

  10

  ?目标富集方法和限制性酶切方法都需要微调覆盖度,以获得最佳的成本效

  益。

  基因分型成本更低(未来)NGG方法已准备好利用未来测序成本的改进。

  ?随着测序方案确定、发表并分享,数据管理的一致性以及样本和基因库的追

  踪将对优化资源很关键。

  11

  ?由于每个个体的方案高度多重且较低覆盖(如浅层测序),故每个实验必须

  考虑杂合子检测的模糊耐受性。

  ?数据分析方法尽管在不断改善,但与芯片的数据分析方法相比仍不够简单。

  这对于物种遗传信息有限的新用户而言可能是个障碍(即无参考基因组)。

  低确认偏好

  对于亲本背景不同于参考的品系或SNP发现群

  体而言,确认偏好,特别是高密度物种,代表了芯

  片基因分型中的挑战。测序方法有着较低的背景

  知识负担。

  ?基于杂交的Pulldown或扩增子方法有可能产生某种偏好。若目标品系的

  限制性位点–保守,则限制性位点关联分析方法在此程度上是没有偏向的。

  5,9

  通过多倍体物种的测序实现更

  宽动态范围的检测

  与芯片方法相比,测序带来的更高等位基因剂量

  检测水平让多倍体物种中多个基因组的等位基因

  检测灵敏度得以提高。

  ?对于每个物种的方案,测序数据的过滤标准可能需要调整。

  ?IlluminaGenomeStudio?软件支持自动的多倍体检出。

  深入了解背景基因组信息未知

  的非模式基因组

  一些测序方案,如依赖限制性酶切位点的方案,可

  在缺乏参考基因组时完成。

  5

  ?转录组序列或重叠群(如>10kb)可作为某些测序应用的推定参考。

  ?在使用与目标物种相距较远的参考(如使用牛作为鲸的参考)时,稀有变异

  会存在高错配率的风险,导致高MAFSNP的偏向。

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  应用聚焦:农业基因组学

  RAD-Seq的方案改进主要集中在增加多重反应的水平,以便降

  低成本,并排除流程中的昂贵步骤,如随机剪切和下游的末端修

  复。排除随机剪切的方法包括MSG、

  19CRoPS、22和ddRADSeq。20

  ddRADSeq方法已被用于细化大小选择,回收随机分布在基因组

  中的“数量可调区域”,而每个样本的文库制备成本为五美元,起始

  DNA量低至100ng。

  20这种方法也采用一种双索引的组合多重系统

  (n*m个个体使用n+m个索引),一种序列过滤分析工具包,以及通

  过GoogleDocs界面获得的样本追踪数据管理工具。在育种和种质

  A.基于扩增子的靶向测序

  PCR

  1个反应=1个扩增子/样本

  多重PCR

  1个样本/反应=60个扩增子/样本

  带索引的组合多重PCR

  96个样本/反应=180个扩增子/样本

  测序

  基因组DNA

  靶向测序

  B.基于杂交的富集测序

  连接接头混合并杂交目标探针分离与目标区域对应的片段测序

  基因模型

  定位的read

  C.代表性降低的限制性酶法基因分型

  限制性酶消化并连接接头

  混合大小选择(可选)测序

  代表性降低

  限制性酶切位点

  基因组DNA

  图1:NGG方法用于SNP的发现和基因分型。基于扩增子的靶向重测序方法(A图)改编自Mamanova等人,201016和Liu等人,2012。

  18基于杂交的富集测序方法

  (B图)改编自Mamanova等人,201016和Cronn等人,2012。

  10降低代表性的限制性酶法基因分型(C图)改编自Andolfatto等人,2011。19

  信息学分析),这让RE-GBS成为从芯片方法转换到测序法基因分

  型的首选。RE-GBS数据分析方法由开源的分析工具(如TASSEL)

  所支持,可利用命令行界面对感兴趣的作物进行定制。表2(来自

  Nielsen等人,201121)显示了现有的非商业化的NGS基因型检出软

  件。Nielsen等人也介绍了一个将NGS数据转换成SNP检出的流程。

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  应用聚焦:农业基因组学

  追踪中执行任一种样本筛查方法时,高通量的数据管理和样本追

  踪都很关键。

  11

  表3总结了已发表的基于测序的基因分型方法,包括基于PCR、基于

  杂交以及限制性酶方法。

  确定测序深度

  高通量芯片(包含从数千个样本中得到的几百万个SNP位点)多年

  来一直用于基因型筛查,通过优化探针设计,杂合子检测率超过

  99.99%。对于杂合性的检测,NGG方法取决于测序深度,而深度增

  加导致每个样本的成本增加。当目标是检测替代等位基因固定的

  亲本系时,杂合子不频繁,且后果少。因此,多重分析程度可以很

  高,且每个样本的覆盖度低至1×,以满足计划目标。对于需要杂合

  子检测的应用,基因型丢失或不明确可通过更深度的重测序或使用

  “软”二进制分配信息学方法19来克服,这些方法有助于丢失基因

  型的推算。Li等人(2011)为确信检测SNP所需的覆盖深度提供了有

  用的建模分析,并从2×、4×、6×和30×覆盖度的测序运行中检测

  杂合子,以及群体中一系列最小等位基因频率。

  23对基于测序的基

  因分型决策而言,丢失数据的容忍度是关键的考虑因素。

  与所选择的NGG方法无关,标记密度、read深度以及多重分析的程

  度和每个样本的成本等因素之间也有折衷。在RE方法中,靶定的标

  记越多(如四个碱基相对于六个碱基的酶切),创建的片段越多,则

  需要的测序也越多。预计改进后能降低测序成本,且read更长,多

  重分析个体之间的覆盖均一。所有这些将实现基因组区域与性状

  之间的更快关联,且每个样本的成本更低,也使得农业物种的分子

  标记辅助育种得以改善。

  芯片的价值

  尽管芯片不再是唯一的解决方案,但芯片方法仍适合筛查应用,特

  别是注释清楚的基因组,其中的性状关联和功能丧失变异已明确。

  例如,许多农业研究群体需要工具来进行已知标记的常规检测,以

  及一致的高通量数据分析,对此,批量定价带来的每个样本的成本

  使得天平向芯片方法倾斜,而不是NGG方法。当整个研究界集中

  图像分析和碱基检出

  read定位

  重新比对、删除重复的read,并重新校准质量分值

  SNP过滤以及SNP或基因型质量分值的重新校准

  多样本检出

  利用非连锁的多样本分析

  促进候选SNP集合和基因

  型检出

  利用连锁的多样本分析深化

  候选SNP集合和基因型检出

  利用单样本分析鉴定SNP和

  相关的基因型

  单样本检出

  图2:将NGS数据转换成基因型检出。来自Nielsen等人,2011。

  21首先,预处理

  步骤将NGS数据转换成比对read,带有表示置信度的质量分值。接着,利用

  多个样本或单个样本的检出步骤来进行SNP或基因型检出,这取决于样本

  数量和覆盖深度。最后,后处理步骤过滤已检出的SNP。

  表2:现有的非商业化的NGS基因型检出软件

  软件来源检出方法前提条件

  SOAP2soap.genomics.org.cn/index.html单个样本高质量的变异数据库(如dbSNP)

  realSFS128.32.118.212/thorfinn/realSFS单个样本比对的read

  Samtoolssamtools.sourceforge.net多个样本比对的read

  GATKwww.broadinstitute.org/gatk多个样本比对的read

  Beaglefaculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.html多个样本LD候选SNP,基因型可能性

  IMPUTE2mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/impute_v2.html多个样本LD候选SNP,基因型可能性

  QCallftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/rd/QCALL多个样本LD一组密集基因座上的‘可行’系谱,基因型可能性

  MaCHgenome.sph.umich.edu/wiki/Thunder多个样本LD基因型可能性

  改编自Nielsen等人,2011。

  21

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  应用聚焦:农业基因组学

  于一种常用工具时,我们有机会利用多样的数据组,并开发下游

  的推算方法和专有的自定义或AddOn内容。例如,较低密度的芯片

  (<50,000个SNP+插入缺失)可以作为基本内容,来构建专有的

  AddOn集合,以便将公开和私有的标记内容混合在单张芯片上构

  建一张专有芯片。这种基于芯片和测序的组合型基因分型方法已

  经为奶牛养殖业贡献了重要的价值。如千牛基因组计划(1,000Bull

  GenomesProject)所示,两种技术的融合可对组合数据集中的相

  关个体进行高度准确的推算。

  24Illumina提供了全面的测序和芯片

  方案,可针对任何物种进行定制。

  表3:现已发表的基于测序的基因分型方法

  方法类型描述

  扩增子测序基于PCR

  通常用于以16S片段为目标的宏基因组应用中。扩增并标记多个目标,以便优化测序覆盖度,工作量大。

  目前难以扩增,无法利用测序产量来降低每个样本的价格。

  LR-PCR基于PCR

  利用长距离PCR(<35kbp,通常在3–10kbp)来扩增目标区域,之后在制备文库前需要剪切。挑战包括

  样本/片段的等摩尔混合。将扩增子重叠增加到最少100bp,可解决覆盖度的下降趋势。

  10,16

  分子倒置探针全基因组

  分子倒置探针是带有通用接头、两侧为目标特异性序列的单链寡核苷酸,它与目标序列退火,并通过连

  接酶环化。PCR扩增后产物直接测序。适合少量目标和大量样本(>100个样本)。

  25–27

  WGS/基因组浅层测序全基因组

  全基因组测序包括DNA剪切和接头连接前的修复。全基因组的低深度或浅层测序适合细胞器(叶绿体、

  线粒体或rDNA)、系统发育/系统学或比较分析。可提供低拷贝核位点的部分序列,以便设计PCR引物和

  探针,用于后续的杂交法简化基因组分析。

  13

  OS-Seq基于杂交

  寡核苷酸选择性测序是一种靶向的基因组重测序,其中Illumina流动槽上的寡核苷酸引物经过修饰,可

  作为捕获和测序底物。

  28

  芯片杂交捕获(带或不带

  C0t1)

  基于杂交

  片段文库与固定探针杂交。非特异性的杂交被去除,目标DNA被洗脱和测序。工作量不如PCR扩增那么

  大。后续可采用目标特异性芯片,来富集复杂度较低的样本中的目标。

  15,16

  溶液杂交捕获(带或不带

  C0t1)

  基于杂交

  针对测序文库中感兴趣的目标区域设计特异性探针。过量的探针使得杂交效率比芯片法更高。通量更

  容易扩展。

  17

  CRoPS限制性酶消化

  利用AFLP和新一代测序来降低复杂度。利用两个或多个遗传上多样的样本的标记文库来发现SNP。利

  用甲基化敏感的限制性酶,以5–10×冗余度测序。鼓励使用纯合品系,以便选择低拷贝或单拷贝的基因

  组序列中的SNP。

  22

  RAD-Seq限制性酶消化

  利用限制性酶消化基因组DNA,并在兼容的粘端连接带有条形码的接头。带有不同条形码的DNA样本

  经过混合、随机剪切和大小选择(300–700bp),在补平和填充末端后连接第二个接头。Y-接头确保只有

  RAD标签在PCR步骤中被扩增。

  5

  CornellGBS限制性酶消化

  采用未经修饰的接头(不带有5'磷酸基团和分叉),省去片段大小选择。通过单孔的基因组DNA消化和接

  头连接,减少了酶切和纯化步骤的次数。使用甲基化敏感的酶,以避免植物基因组的重复区域。

  9

  CornellGBS改进版限制性酶消化

  对原先的CornellGBS方法进行了改进,使用两种互补的酶(一种“稀有”,一种“常见”)和Y接头,其中接

  头1和接头2位于每个片段的相对两端。

  8

  ddRADSeq限制性酶消化

  沿用RAD-Seq的概念,但省去了随机剪切。明确使用大小选择来回收随机分布在基因组的数量可调的区

  域。提供索引、计算分析工具包以及轻量级的数据管理工具,有助于数百名个体的多重分析。成本降低主

  要是由于省去了随机剪切及随后的末端修复。

  20

  GR-RSC限制性酶消化

  基因组简化是基于限制性位点的保守。包括用稀少和常用的限制性酶对DNA进行双重消化,用5'生物素

  标记稀少的识别切割位点,利用顺磁珠分离,通过PCR添加条形码序列,样本的等摩尔混合,通过凝胶分

  离来进行大小选择。

  29–30

  MSG限制性酶消化

  多重NGS方案(包括片段大小选择步骤)的开发是为了同时鉴定多个样本的重组断裂点,其分辨率满足

  大多数的定位目的。融合WGS和RAD-Seq的各个方面。使用比RAS-Seq更频繁的切割位点,在单个步骤

  中将接头与多个基因组小片段连接。对测序方向而言,片段方向是随机的。在接头连接之前没有DNA的

  剪切或修复。

  19

  DArTSeq限制性酶消化利用限制性酶以及测序来降低基因组的复杂度。

  31

  结语

  基因分型芯片为农业中基因组学的发展奠定了基础,鉴定出与期

  望的表型性状相关联的SNP,让研究人员可利用它们来改善畜牧养

  殖和农作物产量。测序技术的快速发展也在推动低成本的基于测

  序的基因分型方法的开发,它们将让农业基因组学研究人员能够

  以前所未有的水平研究家畜、农作物和生物学系统。NGG方法带来

  了基因组范围的视图,提供了加速农业研究所需的特异性、重复性

  和效率,可推进高价值性状筛查方法的开发,并使这些方法在现实

  世界中被快速采用。

  仅供研究使用。不得用于诊断。

  应用聚焦:农业基因组学

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